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4月8日 试验注意事项好久没认真的去DXY，今天认真一会，看到这个帖子，转载过来，确实觉得很有用。。。
实验中的每个环节都很重要，忽略任何一个都可能导致实验的失败，每个人在实验中都有自己的一些好的细小的习惯
例如tip头吸完后马上从移液器上取下来，以免忙乱的时候又以同一tip汲取另一种试剂 用完量桶或者烧杯后，及时清洗，并放入烘箱。 不管大小实验，做完后都要认真做记录。 一个枪头如果可以连续吸两次的话，也不能吸，主要是第二次吸时不准，同时也不能完全打出来。 做完实验擦干桌子，一切东西归位，有些东西可以回收的就回收，很多实验室的枪头是回收的 实验前认真设计，作实验时不胡思乱想，叽叽喳喳，做完后再海阔天空，认真分析试验数据 做之前认真设计，做时就不要老是想着结果,平心静气,注意细节，认真记录，因为失败时常事，不要回过头不知道该从哪里找原因。 每次的实验结束，要及时做好记录，不要等。好记性不如烂笔头，这虽然是俗语，但是不要放弃笔的重要性！ 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均 做完实验，清理实验台，以便下次能够更快、更好，更方便的继续工作！药品归位，仪器归位！ 做实验一定要有计划,最好在有部分实验数据出来时,就着手写文章,这个不是为了出文章 ,而是在写文章的时候,可以清晰自己的思路,知道后面该先做什么,该重点做什么.不然有时候辛苦半死,数据太分散,不能说明问题. 不轻易用别人的东西，用时先打招呼，记录要详细，配液体时要记录试剂的批号等? 所有的东西都要及时标记好，日期，药品名称，浓度，等，实验记录要记录这些内容 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。 不用酶标枪时不要一直拿在手里，不可以倒过来（特别是里面还有液体的时候） 不要一直说话、聊天~~ 笔记要全~要多全有多全~ 还有一点很关键，笔记要放好，最近我的笔记掉了~哭死 最后，做完实验要洗手~ 离开实验室前或进入实验室前注意水，电是否安全 试验之前看资料的时候，最好规类存放，看过后记下重点内容，并将出处标明，以免日后找不到 一定要记着关水浴箱，切记切记。 1、先写实验步骤再做实验，实验的间隙注意写下实验现象的描述，实验后注意实验数据的整理和分析。 2、试剂最好自己配，公用的试剂第一次用时要做质检，并注明时间和谁配的，实验室中每个人都应该有个单字母缩写的名字。 3、认真做好实验前的准备工作，包括试剂、仪器的准备，实验方法的确定，请教一下做过类似实验的人。实验不单单是做出来的，还要有你的思想在里面，否则和一个操作工有什么区别。 4、EP管上一定要做好标记，写上日期，同时记录本上应该有详细的情况。重要的东西可以再加贴一张标签纸，在冰箱中反复冻融会使字迹模糊，可以再用透明胶带纸贴在字外面。 多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了!希望有帮助 实验前多想想，不要着急动手，在脑子里把全部的实验过程过一遍，尽量做到一次成功。要学习美国人的精神，尽一切努力做好这一次，不要想着这一次作不出来再做一遍，这样永远都作不好实验。 注意他人的安全，注意自己的安全，注意实验室的安全！ 作实验的时候不要想其他的事情，想其他事情的时候不要作实验！ 大胆尝试，不要怕做不出来。尝试越多，获得原创性发现的可能越大。 作好预实验，先动脑后动手，作完以后要思考。 实验过程中不要与人海聊，以免污染。 用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面。 记得一个NOBEL获得者说过：在实验室工作时什么都不要想，要专心于手头的工作；作完实验，要海阔天空地联想， 特别是实验的新思路和方法。 我认为要有风险意思，有些实验你要费很长时间的，或要花很多钱的以及结果对你接下来的实验很重要的，最好做一份详尽的试验流程图贴在试验台前，需要特别加以注意的地方要特别标注，可以随时参照。 你一定要仔细准备，争取一步到位，这样不用又费力又费钱！实验前最好做一个flow chat！ 做实验前,设计好时间安排,可以在有限的时间内做更多事.利用起离心和电泳的空闲时间补上记录和作一些整理工作 最好不让干燥箱过夜 取用有盖子的器皿时，不能抓盖子，以免脱落! 湿手不可握光滑玻璃器皿，以免滑脱！ 我觉得做实验要清楚自己所做实验的原理，这样通过仔细记录每步实验的操作，才能找出实验失败的原因。 不用别人的试剂。 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。 不要太迷信kit，有时候土办法更有用。 首先要靠自己，但也要多交流 当天事要当天毕 认真记录 团结周围的实验同事，因为成也他们，败也他们，这是顺利完成的关键，毕竟良好的人际关系和环境是舒服的 1, 事前充分设计 2 事时认真观察，及时记录，无论好坏 3 事后及时处理数据。 4 遵守实验公约，东西及时归原位。 5 及时处理垃圾整理物件等等 正式实验前的预备实验很重要。这样可以把一些你原来根本就没想到的漏洞补上。还有就是动手前尽量完备自己的protocols。 作实验时认真思考，对每一个步骤都提前想想。实验完毕后，收拾好自己的桌面，在用枪时务必注意轻轻吸液，以免吸到枪里面，很容易就会将枪腐蚀了，而且容易污染以后的实验。 一次最好只跟改一个实验条件，不然就搞不清楚到底是哪个条件改变影响了实验结果我觉得做实验最重要的是耐心和细致. 还有一点就是要做到不耻下问! 实验前充分思考可能出现的问题和结果，试验过程中则不能被自己预计的结论左右。试验结束后尽快整理试验数据，该统计分析的就分析，该作图的作图。同时，查阅文献,对自己的试验结果能够准确解释 2月2日 屋漏偏逢连天雨虽然很晚，还是上来说几句。很累，不知道是我心态问题，还是其他，现在做实验的动力不足，感觉自己进入低潮期，天天跑上跑下，感觉快累死～晕晕的～ 本来状态就不好，今天竟然找不到东西。当场蒙掉，半胱氨酸盐酸盐没了。。。唉，这个配方里必须的，虽然用量不多，当时真的想罢工，眼看就2号了，很多地方也歇班了，说服了自己好半天，而且内分泌所那边也约好了，还是做下去吧，一拖会拖很久的。抱着试试看的心态打电话，结果对方还真的有，不过需要明天自己去拿。明天，来是来得及了，我后天才用这个培养基，不过跑来跑去，想想就累。幸好师妹很好，说帮我拿，明天还过来，真的很感谢～至少可以让我少去一个的地方，本来时间就不怎么够用。 今天又让我体会到了计划不如变化，每次配培养基，计划都是2天的，上次因为血清迟迟不到，这次试剂又没了，汗。。。每次实验前，都希望自己可以未雨绸缪，每天想呀想，做前，一定给自己规定好，甚至规定到几点，不过总是有意外存在，头疼～可是计划还是要做，要不一点我更不知道做什么了，到实验室里全是事，可一天忙忙碌碌下来，却没什么成就感。 今天配氯化镧，也很郁闷，虽然以前算了很久，但后来配完了，写总结的时候，却发现自己弄错了一个数量级，差了10的3次方。反正也没溶，最后重配的。一个DXY的战友建议我用PBS，第一次PBS配变混浊，我还以为是氯化镧的溶解度的问题，后来还高压了下，结果出现絮状，那时以为是我数量级错误，氯化镧可能溶不了那么多，后来又用新的量去配，发现加入PBS后，溶液立即成为絮状。严重怀疑PBS和氯化镧反应，第一反应用生理盐水重配（其实当时真的不想试了，爬上爬下，已经走不动了，不过如果今天不做，明天种细胞，后天就要用药，迫在眉睫，我不喜欢这么紧张），所以又去配。还好，溶解了。不过不知道用生理盐水溶药可以吗？因为多数文章里溶药确实用PBS，如果水溶性的会选择DMSO。不过反正N·S总比水强，先试试吧～明天打算再试试氯化镧可不可以高压，因为用滤器过滤太浪费了，我觉得盐类应该都可以高压的，反正有一段UV时间，可以试验～ 本来想今天带师妹处理一下胶塞，终于发现，相同实验，每个人遇到的问题不同。今天自己也学习了。上次我煮的时候，发现水后来变得有点绿，不过后来换酸煮，又正常了。今天师妹可能因为配液没注意，碱全部煮干，胶塞也全部报废，彻底了不用处理了。。。不过知道了，胶塞煮的时候一定不能煮干，而且电磁炉不同于电路，火力太大，记得一定要关小火。上次不知道为什么变绿，这次了解了，也算有收获，就是还要去别人那再拿这些东西。不过至少最近没处理的了，减少我年前的负担～^^ 配TBE，EDTA死也溶不了。上次人家溶的时候，你不参与讨论，这回傻了吧？回来去DXY查了下，发现DETA必须溶在强碱里，7.5～8。晕，原来这样。TBE，正好Tris也是PH8的，明天重配，应该没问题。查EDTA中无意发现的，终于知道文献最后为什么用比较弱的超声了，原来超声除了可以破碎细胞，还是助溶。不过很难查到功率呀，自己瞎试吧～头疼。。。 明天要接种24孔板，紧张呀，完全没看别人做过，自己瞎参考中。不过我觉得我订的细胞浓度是对的，只是接种手法要小心，怎么能让他铺匀。网上关于是否要十字摇匀，众说不一，晕，分别information很困难滴。。。不行就只能试～ OK，就这么多，累也要跑过来写，因为感觉今天还是学到挺多的。其实感觉这次这个方案蛋白应该可以提出来，当然是在不出意外的情况下，我不知道这次培养基会不会有问题，不是我配的，应该没有吧，我和师妹都是检验系的，这个都做过的～保佑～ 11月22日 万里长征第一步～ 昨天从同学那拿来细胞。开始同学让我去拿的时候，没想过昨天就要传代，因为看文章说一般要稳定一天。不过，昨天同学说，如果我东西都准备好了，还是拿回去传代吧～因为没计划准备，所以思考了半天，骑车的时候也走神了，走错路了～^o^。后来，决定把超净台照1个小时，好给我时间思考，也准备点东西。
紧张了半天，最后还是传代了，因为自己定的目标是12月前把练习的细胞弄顺了，所以按时间来说，昨天传代还是合适的。
传代就问题多多了～对细胞的形态掌握不好，不知道什么是过，什么是不过。后来问师姐，师姐说：细胞周围变亮，翘起，估计就消化的差不多了。吹打的时候，因为上次泡沫阴影，又把培养基加少了，结果吹不起来，又加培养基，不但费了吸管，而且弄得泡泡满天飞，幸好是练习，要不我得心疼死。。。也不知道接种多少细胞，可以达到我的要求，明天（今天）可以长到我要的浓度，一个换液/传代；一个换液准备后天冻存。如果顺利的话，冻存的时候可以练习下计数，冻存好像不像传代，怕细胞又贴壁，忙得手忙脚乱的。我觉得，传代这个，我应该练很多次，减少气泡，掌握数量和时间。
保佑明天去看的时候细胞平平安安，至少没长菌，长的不好还是可以容仍的（由于我消化过了的话），至少它可以慢慢长起来，污染了，就功亏一篑了，还要麻烦人要细胞，而且也打击我的信心(这样东西本来我就很少)～～。昨天做的时候最后感觉犯了个错误，把细胞放孵箱后，因为太担心，又去看了它一眼，感觉培养基在瓶口乱晃，希望没有污染，液体到瓶口的时候通常很容易污染，虽然我很肯定我把瓶口烧了很多遍～ 吓担心也没用，明天就知道了～
有时想想，事情真是恐怖，我要这样一直坚持走下去，现在真的是万里长征的第一部，而且是最简单的一步。养细胞，至少操作小心，保持无菌观念，应该可以顺利。但是后面的MTT，PCR，Western想想。。。唉，条件、试剂、配置、结果，操心呀……不过马上就25岁了，也是该有越来越多操心的事的时候了，不能一直傻傻的活着～
我想要个架瓶子和移液管的架子，为了试验方便，就和我的“后勤部长”——老爸说了。老爸真是对我宠爱有佳，听姑妈说，爸爸那天什么都没做，开到老远的地方给我找有机玻璃，粘胶，下午又割又磨的，给我做好了。爸爸为了做的漂亮，折腾了半天（其实和爸爸说过的，拿铁丝做一个就好，可是爸爸说这么大个实验室，用个铁丝的多难看～）。真的很谢谢爸爸，每次让爸爸帮我做事，爸爸都是以我为第一，一定帮我做到最好。每次我给爸爸做事，总是耍小姐脾气，没有一次不发脾气的，虽然最后也做完了，但是可能真的让爸爸觉得很伤心。而且每次帮爸爸做事，爸爸都要求我好多次，我还真是很不乐意。我要说我忙，爸爸就会拖几天，再让我帮他做。我真的很自私～很内疚，下定决心再也不闹脾气了，不过今早打字，差点又不乐意了～ 我真是个坏孩子。。。
最近在魔法师那，很开心，大家对我的译文还算满意，有时能收到一两句表扬，至少给了我些许信心。不过这两天的文章翻译的不大好，老师给的分数也不高，我看我需要反省，应该是翻译的时候斟酌不够。
还有很多事情没做，时间总是不够用，如果我能少睡点觉就好了。
前两天坐车看了《永远的普罗旺斯》，虽然没看完，不过也大概了解，好像这本是作者随笔性质的，有点零散，没什么特别感觉，不过也许我选择的看书的地方不好，我想如果在图书馆，阳光照耀下，读这本书应该感觉很好，可以在想象中享受普罗旺斯的阳光和整片整片的薰衣草。另外，我觉得《普罗旺斯的一年》会好看。今天一心血来潮，正好当当在做活动，买书免邮费，所以又去搜书了，一买有多了，结果看上的书要花我72，可惜卡里只有70，买书计划流产。。。因为最近可能没机会去银行～希望我存上钱的时候，当当还在免邮费中。
今天送来了最后一本《新东方英语》，订了几年呢？不知道想不起来了，从新东方出杂志开始就在买吧。明年开始，不订了，所以今天纪念下～～ 11月16日 等待结果。。。 今天分装了胰酶，向培养基中加入了血清。感觉做的不大好，没统筹好，事事遇到问题。
二氧化碳培养箱开气瓶竟然开错阀门了，幸好没拧开，爸爸说那个是打压阀，开了就爆了，应该是开上面的直角阀。都怪自己，上次不好好听爸爸说话，结果今天碰到问题，不过幸好，问题不大，最多折腾半个小时解决了。
Second， 生物安全柜，觉得blow了半天，仍然unsafe，给客服打了两个电话。后来等待中才发现安全柜上面写着鼓风要20分钟左右，确实大概20分钟以后，确实进入safe状态了。虽然说明书看了很多遍，但是真正操作还是记性不好。还有短期出去拿东西，还是不要关风机，要不再开又要等20分钟，很浪费时间。不过这个也好说，一次做过了，至少未来一段时间没有问题。因为滤网之类的有指示，所以那个到更换时，我应该可以知道。
然后就是胰酶和血清，没想到我在4度放了一夜，室温又放了一会，还是化的很慢。不知道分装的好不好？我近火烧的太多会不会影响胰酶的活力？还有一个疑问：培养基之类的东西，可不可以在紫外下照射？（DXY好像说的不可以，至少曾经见过；师姐告诉我可以；书上写的不可以，混乱～～）很想知道不可以的原因是什么？查找中。。。
这次高压也没经验，应该先问问别人的，饭盒里忘垫纱布之类的东西了，上层也是要铺一层，这样减少污染的概率。
今天最成功的就是调D-Hanks的颜色，感觉今天颜色高压后，正常些了。不过最新消息，内分泌所得D-Hanks根本没必要加酚红，因为酚红影响观察。只是在配胰酶的时候，才加酚红到D-Hanks里。另外，大家都说洗细胞的东西，酸了，碱了，影响不大，洗洗而已，不过我希望还是有个标准。D-Hanks高压前一般调到7左右。PH计应该没问题，以后水好了，估计配这个我可以很自信的做了。
现在的心情就像等待考试心情，忐忑不安，什么都做不了。因为今天配的培养基正在做无菌培养，希望它明天是无菌的。好害怕，一想起明天结果就很害怕。其实想想，也不知道哪里可以发生污染～ 瓶口都烧过，移液管之类也好好烧了，超净台用前酒精擦了，UV照了30分钟，然后用的时候又用酒精擦了，而且它自己本来就是净化级的。外面也用紫外线照过，地面用0.2%的新洁尔灭擦过。可是宿舍师姐说，细胞培养有时很奇怪，越小心，越出事故，什么都不在乎到没事。唉。。。担心呀。实验都是一环接一环的，希望明天没有污染。因为污染了，我都不知道哪有问题？ 大的培养基还可不可以信我都搞不清楚。而且理论上，明天细胞过来，如果污染了，那我用什么？God bless me。 有时真的想冲动的去庙里求求，当然这个不管了，所以想想就算了～
最痛苦的，不知道哪些操作时无菌的关键，怕把不该做的做了，该做的没做。继续学习吧～ 保佑明天是个好结果。。。
11月9日 实验---Hanks （出师不利） 真的觉得自己是“事故大王”，奇才呀，配个Hanks也出问题。无语。。。
昨天晚上准备的时候，就发现网上有写Hanks高压后出现沉淀。我今天忙了一天，结果高压出来发现也有沉淀？不解～
因为内分泌所那边Hanks确实是用高压的？虽然免疫是用过滤的方法。
只是我对过滤还没信心，因为上次在内分泌所看他们过滤实在是非常小心。滤器现在我不知道怎么处理，问了问老师，老师说用洗涤剂刷刷就行。另外出口需要配一个胶皮管，真的不知道到哪找？问老师，老师说在西南角卖五金的地方，晕～不认识。决定明天在塘沽搜寻一下，爸爸说他对橡胶很了解，说了一通天花乱坠，搞得我更不知道买哪种了？问买仪器的，他没给我回复，等他送血清的时候，我得再问问，明天先去搜一下。另外，滤纸也得寄过来，估计最早要周三到。所以我现在不能用过滤的，只能高压。
今天事故的原因：
1. 在网上说： Hanks高压温度不能过高，10磅（115度）10分钟。我今天用的15磅（121度），20分钟。因为自动的只有这个选项，要用10磅得自己看锅，我怕我我放气放不好，瓶盖再飞了，不过无论怎样，结局今天还是失败了。（最不能接受的，怎么看上去这么简单的一件事还是出问题了？）
2. 书上说，一个试剂溶完，再溶另一个。可能是一开始的氯化钠，含量比较多，转子又比较小，没转匀，我也买看清，就加了后面的东西，结果加到中间，才发现。也没重做，不知道这个影响不影响。我觉得影响不大。（PS：到现在不理解，为什么一些盐类加法还有先后顺序，而且网上说法不一，有说需要按顺序，有说不需要的，我要再去查查）
3. 高压之后，我在85度的时候，就开锅盖了，不知道这个突然的温度变化，对试剂有没有影响？个人认为这个也不是主要原因。
4. 不知道转子的转速对配制试剂有没有影响？
我觉得可能和高压的温度太高引起的，去问问，然后记录在这里。
另外，还有说如果高压有沉淀，可以分别高压氯化钙溶液和剩下的混合液，然后无菌下混合。可是这样容积很不准呀？不理解怎么做的？
情绪：
其实被打击到了，不过不想让自己这么想。Hanks这东西，貌似真的没什么技术，怎么会这样呢？操作流程也会出现BUG？今天从11点一直忙到下午4点，结果竹篮打水一场空。我觉得跑步的时间太多了，这屋那屋的来回转，有点浪费时间。下次还要更好的做好计划，没想到今天洗瓶子洗了这么久，感觉还有一些细节不懂。周一要再问。另外，实在没办法了，请了个老师，只是老师很忙。期望她可以有空，有空来看着我做，这样我才知道哪错。进步才会快～
换个角度，就像小项说的，碰到问题，才是幸运，这样才知道怎么解决。所以，可能我是幸运，就是希望能快点解决。周一或周二再战吧。别因为失败就失望～
近期目标：做好培养，学会柔弦。
结果：
从坛子里回帖结果看，貌似Hanks确实不能高压。因为存在钙、镁离子。一个战友解释，和烧开水道理相似，水因含钙镁，所以加热会出现水垢。而且刚刚才知道，师姐他们配的D-Hanks，不是Hanks，D-Hanks 和 Hanks最大的区别就是没有钙、镁和葡萄糖。所以，这个理由似乎可以接受。
可是为什么司徒镇强老师的《细胞培养》中流程却写了Hanks可以高压呢，而且温度极高，356.18kPa，刚刚查了一下，100多kPa就是121度，那300多kPa得多少度呢？不解。。。怀疑书编写错误。
另外，网上有一个应该是某学校细胞培养实验教程，里面也说可以高压，只是温度在10磅。不死心，明天要试一次～（主要滤器出口还有问题，不能用，实在没辙，只好救急买一瓶了，周三或周四，细胞必然会过来。一拖再拖，总是开展不了，而且和同学说了好多次了～～～）
Appendix:据说加试剂的顺序确实没有影响，因为都是无机盐。。。
（明日待续结果。。。。明天肯定很忙。。。估计读完研我能瘦到90斤，不过也说不好，压力一大，吃多了，搞不好又成猪了～～～） 4月6日 血培养基的制作 虽然以前本科也做过血培养基，不过以前分组配培养基时，我没分到配血的，所以等于本科期间不会配。
今天和老师一起给别人准备实验材料，要倒很多很多血碟，终于知道怎么做了。
首先，在不同温度下加入羊血会呈现不同的颜色。血碟一般在45度左右加，也就是比皮肤稍微热一点，而且血不能加入太多，太多会导致培养基冷却很快，还没来得及倒碟，血琼脂已经凝固，一瓶就全都浪费了。因为血琼脂是不能再化的。另一方面，巧克力培养基，也不是加热血就配出来了，而是要在90度左右加入血才可以，其他温度加入的，做出来的也不能用。
感觉倒各种类型的血碟，关键是掌握温度。而碟子合格不合格，至少首先要保证颜色正确，然后再看看污染问题……
血培养基配方： 血琼脂平板（BA）
制法：取营养琼脂（PH7．6），加热使其溶解待冷至45-50℃，以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血或兔血5-10毫升,轻轻摇匀，立即倾
注于平板或分装试管，制成斜面备用。
PS： 1. 血碟易凝，所以最好200ml一瓶，然后倒碟。 2. 大部分合成培养基其琼脂含量都不足，最好再补充一些琼脂粉以增加硬度。 |
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